全面解析HPV感染、促癌机制及HPV疫苗如何做有效验证？

人乳头瘤病毒（HPV）是一种常见的嗜上皮细胞病毒，可引发宫颈癌等多种癌症。本文将通过介绍HPV结构、感染分子机制、中和免疫机制等来详解HPV预防性疫苗的重要性，评估疫苗效价，及接种有效性的方法。

HPV结构组成

 

HPV是一种双链无包膜的DNA病毒，携带7-8kb的环状基因组，其具有双重启动子，分别编码病毒复制所必需的非结构蛋白--早期蛋白（E1、E2、E4、E5、E6、E7、E8）以及病毒粒子组装和衣壳形成所需的结构蛋白--晚期蛋白（L1、L2），非编码部分LCR区包含复制所必需的顺式元件并调节病毒DNA转录。

Pig.1HPV-16基因组结构

HPV分类

国际癌症研究机构（IARC）依据其感染诱发宫颈癌的风险，HPV可划分为高危亚型（HR）和低危亚型（LR）。两者感染均可引起人体上皮细胞的鳞状增生。其中高危HPV亚型与宫颈癌、肛管癌、阴茎癌、口咽癌等肿瘤发生密切相关。低危HPV亚型感染可诱发生殖器疣等皮肤与黏膜系统疾病。

HPV感染机制

HPV病毒的生命周期与感染的上皮细胞分化相关，常感染活跃分裂的基底层细胞。因病毒本身无法编码促基因复制的各种酶，HPV需依赖宿主细胞进行自我复制。在初始建立阶段，病毒进入细胞核后进行转录扩增，并在宿主细胞维持50-100个低拷贝。之后随着病毒进入溶原循环，增殖速率增加，在每次进入细胞周期的S期时进行一次复制。病毒从角质形成细胞中组装并分泌，以建立持续感染。漫长的病毒潜伏期间导致癌前病变的产生，并增加细胞发育不良。病变或被机体自行免疫恢复，或进展为侵袭性癌症。

Pig.2HPV感染机制   HPV的免疫逃逸策略

 

HPV使用多种策略来下调免疫反应，这些逃避机制促进病变从感染发展为癌症。HPV可利用病毒抗原的低水平表达逃避免疫细胞的识别，无病毒诱导的细胞裂解或坏死限制了免疫细胞对HPV的作用。HPV通过DNA甲基化的扰动改变了宿主细胞的基因表达，导致免疫应答的趋化因子、粘附分子和Toll样受体（TLR）等下调。在HPV感染的角质形成细胞中，干扰素通路通过E5、E6和E7与干扰素反应因子（IRF）结合并破坏。据报道，HPV18抑制了cGAS-STING的表达，受感染的HPV16细胞会降低参与抗原加工的免疫蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB9的表达。HPV通过保留在高尔基体复合体中，通过E5癌蛋白下调主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的细胞表面表达。综上所述，HPV癌蛋白对免疫应答的下调使受感染的细胞能够逃避免疫细胞并促进病毒持续感染。

 

HPV的促癌机制

 

在HPV感染进程中E6和E7基因产物通过结合和灭活肿瘤抑制蛋白、细胞周期蛋白和相关激酶来破坏细胞生长调控途径并改变细胞环境，以促进病毒粒子在细胞终末分化期退出复制。E6基因产物与p53结合并通过细胞泛素连接酶靶向其快速降解，p53突变致使调控G1阻滞、细胞凋亡和DNA修复等功能丧失。E7基因产物与Rb蛋白家族以低磷酸化形式结合，细胞转录因子E2F-1释放游离，导致细胞异常DNA合成与增殖。总体而言，病毒基因组会整合到宿主DNA中，细胞周期失调，增殖失控，基因组不稳定性和非整倍体增加，最终进展为癌症。

pig.3HPV促癌机制

HPV疫苗的免疫反应

 

目前最有效的预防性HPV疫苗基于病毒样颗粒（VLP）开发，通过L1蛋白的自我组装 能够生成模拟天然病毒并引发高滴度病毒中和抗体的VLP。比起机体自然低免疫反应，VLP具有高免疫原性，衣壳抗原直接暴露于全身免疫反应产生诱导高水平特异性中和抗体。

Pig.4预防性疫苗的生产机制

Pig.5疫苗诱导的免疫反应

HPV疫苗的有效性验证

HPV疫苗接种后因个体差异，应尽早评估抗体水平。现阶段常用的血清抗体检测方法主要包括假病毒中和抗体检测法（PBNA法）、竞争性免疫试验（CI）以及HPV型特异性VLP-lgG结合试验，其中最能反映血清抗体中和活性的方法是PBNA法。

以假病毒为基础的中和抗体检测方法模拟中和抗体阻断病毒进入细胞的生物过程，能直接反映抗体的保护效果。与传统方法相比，基于假病毒的中和抗体检测方法具有简单快速、准确可靠、高通量、高灵敏度等优点。同时，假病毒仅具有单轮感染活力，安全性好，从而消除了研究高致病性和高传染性病毒所带来的生物安全隐患。基于应用需求，复百澳开发了HPV中和抗体假病毒。

 

产品说明

 

丨报告基因的选择

假病毒表面含有病毒的中和抗原，且其生物学活性与真病毒接近,这是假病毒可以应用于中和抗体检测最重要的一点 。假病毒感染细胞后，根据报告基因的表达情况可以计算假病毒的感染率 ，从而确定中和抗体效价，常用的报告基因有GFP、Luciferase等。

 

1）荧光蛋白信号的检测不需要底物 ，依靠特定波长激发后可发出有颜色的荧光 ，通过荧光显微镜或流式细胞仪计数发荧光的细胞可以计算假病毒的感染率。

 

2）荧光素酶报告基因表达的荧光素酶作用于底物后释放出光子 ，通过化学发光分析仪记录各孔的相对光单位 (relative light unit，RLU）可以实现高通量检测。

丨假病毒的滴定

根据报告基因在胞内或胞外产生的信号对假病毒进行定量或半定量检测，如：利用荧光素酶产生的RLU信号值对假病毒进行直接定量检测；根据产生绿色荧光的细胞数量计算感染率。

 

丨检测结果的判定

中和抗体与假病毒结合后抑制其进入细胞 ，细胞内信号减少 ，信号减少程度与假病毒被抑制程度呈一定关系 ，且信号减少程度间接反映中和抗体浓度 。

产品列表

 

参考文献：

1、Aggarwal S, Agarwal P, Singh AK. Human papilloma virus vaccines: A comprehensive narrative review. Cancer Treat Res Commun. 2023;37:100780. doi: 10.1016/j.ctarc.2023.100780. Epub 2023 Nov 21.

2、Yousefi Z, Aria H, Ghaedrahmati F, Bakhtiari T, Azizi M, Bastan R, Hosseini R, Eskandari N. An Update on Human Papilloma Virus Vaccines: History, Types, Protection, and Efficacy. Front Immunol. 2022 Jan 27;12:805695. doi: 10.3389/fimmu.2021.805695.

3、Mariani L, Venuti A. HPV vaccine: an overview of immune response, clinical protection, and new approaches for the future. J Transl Med. 2010 Oct 27;8:105. doi: 10.1186/1479-5876-8-105.