引言

2016 年 12 月 2 日，恒瑞发布正式公告，其于 2016 年 11 月 30 日与 Oncolys 达成协议，有偿获得 OncolysBioPharma 研发的溶瘤腺病毒产品 OBP-301 在中国大陆、香港、和澳门特别行政区的开发、生产及商业化的独家许可权。交易金额为不超过 1.02 亿美元，其中首付款 50 万美元，开发阶段里程碑款最高不超过 1450 万美元，销售阶段最高不超过 8700 万美元。

疑问

• OBP-301 溶瘤腺病毒究竟是有什么特别？
• 其做了什么特别的改造？
• 我们在实验室里是否可以 DIY 呢？

我们将从溶瘤腺病毒的研究实验流程、载体改造策略、免疫作用机制以及相关的制备工艺，慢慢聊来……
 

溶瘤腺病毒的研究实验流程

溶瘤腺病毒可以选择性地在肿瘤细胞中进行感染和复制，最终裂解肿瘤细胞并释放出新的病毒颗粒，以感染更多的肿瘤细胞而不伤及其他正常细胞、组织，是一种具有抗肿瘤药效和相对靶向性作用的载体病毒。

目前，有关溶瘤腺病毒的具体构建方法每个实验都有自己的特点，没有统一的方法可循。而目前比较常见的构建方法是基于 Adeasy 和 Admax 腺病毒包装系统。其主要包括以下三个环节：

1. 构建新质粒，包装成溶瘤腺病毒；
2. 体外研究病毒的复制和杀伤效应；
3. 建立动物模型，体内研究病毒的抗肿瘤效应。

 

溶瘤腺病毒的改造策略

随着生物技术的快速发展，对病毒载体的基因改造也越发方便。目前，溶瘤腺病毒改造的策略主要有以下三类:

I. 第一类溶瘤腺病毒，是去除了腺病毒 E1B 55KD 基因，通过此方法构建的腺病毒具有一定局限性，主要在于这种腺病毒只针对 P53 缺陷型肿瘤细胞，而在人类癌症中，P53 大约有 50% 会突变。 如：溶瘤腺病毒 ONYX015（上海三维生物技术有限公司从美国 Onyx Pharmaceuticals, Inc. 获得 CI-1042（ONYX-015）全球性技术和产品的相关权利。）


 

II. 第二类溶瘤腺病毒，是为限制病毒在特异的肿瘤细胞或组织内复制，利用肿瘤特异性启动子如肿瘤特异性抗原、端粒酶和生存素启动子等重组到溶瘤病毒基因组中,并控制病毒复制所必需的基因，进而控制病毒的复制，肿瘤特异性启动子是驱动肿瘤细胞中特异蛋白表达的启动子。,如恒瑞从日本 Oncolys购 买的 OBP-301 溶瘤腺病毒。
 

 Clin Cancer Res. 2004 Jan 1;10(1 Pt 1):285-92.

 

III. 第三类溶瘤腺病毒，是在第二类腺病毒的基础上，对腺病毒衣壳蛋白进行改造修饰，改变了病毒亲嗜性，从而特异性靶向肿瘤细胞。如日本 Oncolys 公司在 OBP-301 基础上开发的 OBP-405，可以感染表面 CAR 受体缺失的肿瘤细胞。
 

 

Oncogene. 2005 Apr 28;24(19):3130-40 

 

溶瘤腺病毒溶瘤作用机制

 

Ø 直接溶瘤

溶瘤病毒感染肿瘤细胞对其直接杀伤，这是溶瘤病毒的概念来源。溶瘤病毒通过特异性感染肿瘤细胞，在其中繁殖，直到引起肿瘤细胞溶解。而其对正常细胞不感染或感染不杀伤。

 

Ø 免疫激活

机体的免疫系统除了灭活病毒外，也可以产生抗肿瘤免疫。溶瘤病毒感染肿瘤细胞后同样也吸引了免疫系统对肿瘤的注意力，并可以产生有效的、持久的抗肿瘤免疫。溶瘤病毒能有效的提高细胞免疫疗法以及免疫检查点抗体疗法的治疗效果，如：溶瘤腺病毒 IL-12p70 和 PD-L1 阻断抗体的组合可以减少肿瘤部位的 HER2 CAR-T 细胞的流失量，提高 CAR-T 治疗效果。
 

 

溶瘤腺病毒与机体免疫系统之间相互作用

I. 逃避机体的抗病毒免疫
机体的免疫系统，可以使任何病毒失活，其是阻碍溶瘤病毒发挥疗效的主要障碍之一，对于静脉注射来说，输入的病毒与血液中的补体以及中和抗体相互作用，很快被清除从而降低了治疗效果。提供溶瘤病毒的治疗效果
必须要解决机体对其免疫清除作用、延长病毒在体内的存在时间。目前常用的方法：
1）通过使用免疫抑制和补体系统的抑制，降低机体对病毒的免疫反应，延长病毒的存在时间，增强溶瘤病毒的治疗效果；
2）通过使用非人类常见病原体的病毒可以部分避免原有的免疫力，延长病毒的存在时间，增强溶瘤病毒的治疗效果。但是，这不能避免随后的抗体产生，容易产生耐药性；
3）利用聚乙二醇等聚合物将病毒包被，使其免受机体的免疫清除，但是这也降低了病毒外壳蛋白粘附在宿主细胞上效率，影响溶瘤病毒的疗效；
4）将溶瘤病毒藏在巨噬细胞内，通过巨噬细胞自动迁移到肿瘤组织区域，该方法已经成功地将溶瘤病毒传递给动物前列腺癌。

 

II. 利用机体的抗病毒免疫引发抗肿瘤免疫

机体的免疫系统除了清除溶瘤病毒外，也可以产生抗肿瘤免疫。溶瘤病毒感染肿瘤细胞后同样也吸引了免疫系统对肿瘤的注意力，并可能产生有效的、持久的抗肿瘤免疫。许多自发缓解癌症的病例已经被记录下来，尽管尚未完全被了解，但可能是由于突然的免疫反应或感染引起的。一些溶瘤病毒具有很强的免疫原性，可能通过感染肿瘤引发抗肿瘤免疫应答，尤其是传递细胞因子或其他免疫刺激因子的病毒。
 

 

Nature Reviews Drug Discovery 14, 642–662 (2015)
 

溶瘤腺病毒制备工艺

 

腺病毒为无囊膜的双链DNA病毒，呈廿面体，基因组大小 ~36kb，粒径 ~90nm，由于其潜在的细胞溶解活性以及对目前其结构和复制循环的详细了解、病毒工程的充分机会、病毒颗粒及其基因组较高的稳定性，是非常具有吸引力的溶瘤“药物”。

 

对于溶瘤性腺病毒的生产，可使用多种生产细胞，如 HEK293、Per.C6、N52.E6、Hela 等，在滚瓶、生物反应器或一次性培养袋内，细胞密度 1-2x10^6cells/mL，一般可获得较高的病毒滴度。值得注意的是，虽然有报导使用了无血清悬浮培养技术，但在无血清条件下生产溶瘤性腺病毒会显著降低病毒产量。此外，溶瘤性腺病毒的生产也会受到所谓的细胞密度作用的影响，即在 ~1x10^6cells/mL 细胞密度时，会限制腺病毒的生产。

 

溶瘤性腺病毒最常见的纯化方法是使用两轮的氯化铯密度梯度超速离心，这种方法可以提供足够科研或临床I期使用的材料，但不能规模放大。所以，对于 ≥10^15 VP 的临床级溶瘤腺病毒载体的大规模生产，开发了基于过滤和层析方法。收获的病毒浓度一般为 4x10^10~5x10^11 ip/mL。另外，在病毒生产和纯化步骤中，上/下游工艺非常耗时，会造成可观的产品损失，所以，需要建立一种在每一独立步骤监测病毒滴度的方法。

 

纯化的病毒需监测效力、一致性、无菌性、纯度、内毒素、污染性宿主细胞 DNA（≤pg/10^11vp）和蛋白质。总VP和感染性颗粒（ip）是比较不同生产工艺的两个关键参数，需仔细确定。FDA 推荐 vp/ip 比值为30，需避免该值偏差过高。
 

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部分参考文献：

1. Nature Reviews Drug Discovery 14, 642–662 (2015)

2.Clin Cancer Res. 2004 Jan 1;10(1 Pt 1):285-92.

3.Oncogene. 2005 Apr 28;24(19):3130-40.