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腺病毒过表达/干扰/敲除载体
￥1000 - 10000
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公司新闻/正文
一文了解病毒载体的选择、慢病毒制备、生产等问题
11454 人阅读发布时间：2019-09-17 14:52
慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内长期的表达。慢病毒载体 (LV) 在基础科学研究、细胞治疗和基因治疗中的应用越来越广泛，本次综述从病毒载体的选择、科研级慢病毒制备、临床级慢病毒生产等方面进行了详实的介绍。
病毒载体选择
慢病毒载体
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体（RNA 类病毒）。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。慢病毒介导的基因过表达，可以实现目的基因在细胞内的长期稳定表达。
构建稳定细胞株的必选载体；
CAR-T 细胞治疗中主要使用的病毒载体；
病毒包装周期，2~3 周内完成；
慢病毒感染细胞多数需要 polybrene 辅助。
感染细胞后 2-~4 天后呈现表达丰度。
腺病毒
腺病毒载体（adenovirus）是以腺病毒为原型进行基因功能改造而成的，无外壳的双链 DNA 病毒，病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近 100% 的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达 11 次方；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。
基因瞬时表达选载体；
高浓度浓缩，可用于动物实验；
病毒包装周期：6~8 周；
腺病毒可以直接感染细胞无需 polybrene 辅助。
感染细胞后 24 H 后呈现表达丰度。
毒种可在 HEK293A 细胞中反复扩增。
腺相关病毒
腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。由于其安全性好、宿主细胞范围广 (分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长，具有明显的组织噬性等特点，这使 rAAV 成为用于基因转移和基因治疗的一个非常有吸引力的工具载体。
体内能长时间表达外源基因；
低免疫原性，良好的基因治疗载体；
较高的生物安全级别
病毒包装周期：6~8 周；
组织噬性——组织靶向！！！
AAV 组织噬性
AAV1：骨骼肌嗜性（包括心肌），神经组织也可以感染；
AAV2：有效转导肌肉，肝脏，脑组织，视网膜;
AAV5：视网膜、神经系统、关节滑膜嗜性、肺；
AAV8：肝嗜性，视网膜、神经组织也可以感染；
AAV9：心肌嗜性，可穿过血脑屏障；
AAV-DJ：广谱性侵染各种细胞，可做细胞实验。
慢病毒包装细胞
293T 细胞，慢病毒包装专用细胞，以及在此细胞基础上进行改造的可以提高病毒产量的细胞，如：293FT，293T-Fubio（复百澳专利细胞）等。
实验 KPI 点：
I. 尽量使用低代数的细胞用于病毒包装；
II. 无支原体等微生物污染；
III. 细胞传代后 24 H 用于病毒包装；
IV. 包装时细胞密度 80% 左右；
V. 转染后使用低浓度血清进行产毒培养。
补充知识： 293 细胞是转染了腺病毒 E1A 基因的人肾胚胎上皮系，293T 细胞由 293 细胞派生，同时表达 SV40 大 T 抗原，含有 SV40 复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T 细胞是亚三倍体人细胞系。染色体众数为 64，30% 的细胞有 64 条染色体。多数细胞 der⑴t（1;15）(q42;q13），der⒆t（3;19）(q12;q13），der⑿t（8;12）(q22;p13），还有四条标记染色体，有的细胞另有 5 条标记染色体。der⑴与 M8 (or Xq+）常常成对出现。N17 与 N22 各有四条。值得注意的是多数细胞有三条 X 染色体，两条 Xq+，一条 Xp+。
慢病毒包装质粒系统
目前，通用的慢病毒包装系统有三质粒和四质粒系统，四质粒系统在的安全性上更好点，而经典的三质粒系统的在操作性及病毒滴度上更胜一筹。
实验中的 KPI 点：
I. 转移质粒：包装质粒：包膜质粒的转染用量：3:1:1；
II. 包装质粒、包膜质粒质粒很重要，建议花点本钱用点好柱子抽提。基本要求无内毒素，260/280:1.80~1.90 之间，电泳条带清晰。
III. 转染效率质控（非常重要），转染后 24 H 细胞形态变圆（如图），48 H 后部分细胞脱落，如果无此现象，后续的病毒将很难获得高滴度。
补充知识：
三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中，包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 (VSVG)，应用 VSVG 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 (绿色荧光蛋白 GFP)。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性。通过三质粒共转染 293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达 10^9TU /ml。
四质粒表达系统, 为了减少 HIV 包装结构的序列同源性，进一步减少重组成 RCV 的可能性，Dull 等人将辅助基因去除。但由于 gag，pol 的转运需要 rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性。
科研级别慢病毒纯化
细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量，而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量，不同的实验室可根据自身的硬件条件及实验需求选择合适的纯化方案。
I. 超滤柱浓缩法
超滤浓缩分离技术，是根据分子的大小来分离溶液中大分子和小分子物质，超滤离心管通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂通过滤膜，而大分子溶质则被截留在样品管中。
基本流程：将含慢病毒上清液转移至超速离心管中，4℃ 离心 5000rpm*30 min，浓缩至 1 ml 或更少体积，收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，实验成本低，病毒纯度较差，毒性较高。
II. PEG 浓缩法
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种无电荷的线性分子结构的多糖，为乙二醇的聚合物，有较强的脱水作用，其能够破坏蛋白质分子表面的水化层而使蛋白发生沉淀，PEG 单独使用时非特异结合高，加入终浓度 0.5mol/L 的 NaCl 有助于病毒的沉淀。
基本流程：将含慢病毒上清液和 PEG8000（或者 4000,6000）按比例充分混合。4℃ 离心 5000rpm*20 min，用 1 mL 或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，浓缩至 1 ml 或更少体积。收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，操作简便，非特异结合，PEG 残留易至细胞融合甚至死亡。
III. 超速离心法
超速离心法是借助超速离心机根据物质的沉降系数，质量、密度等的不同，应用强大的离心力使病毒分离、浓缩和提纯的方法。
基本流程：将含慢病毒的上清液 10000rpm*10 min 除去细胞碎片，上清液用 0.22um 的滤膜过滤除菌后转移至超速离心管中，4℃ 离心 30000rpm*2 H，用 1 mL 或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，再用 0.22um 滤膜过滤除菌，用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求高，病毒纯度高，毒性小，病毒回收率相对较低。这种方法纯化的病毒市场价格相对较高。
大规模慢病毒制备
当转向临床实验时会需要大量的慢病毒载体，而将生产工艺放大则显得极为重要。本文着重介绍以下两种方式的大规模制备：贴壁细胞扩展法 (增加生产单元) 和悬浮细胞发酵法。
采用贴壁细胞大规模生产慢病毒
大多数大规模生产都是小规模生产的直接放大，即通过增加培养/生产单元来实现。生产基本上采用大量的多层培养系统 (Cell Factories(CF)(CF-10)(Figure 2)) 或者 Cell Stacks(CS)。因为易于操作，10 叠层装置 (CS-10) 可以考虑，虽然原则上 40 叠层装置同样也可以用，但是因为它重量增加的原因所以需要特殊的处理系统。此外，每层平板的气体交换及培养基层不可能一致，因此用显微镜控制 40 叠层装置细胞的生长很困难。生产要么采用放在层流工作台的开放模式，要么采用半封闭模式，后者对操作人员、环境及终产品的安全性更高。
收获是通过简单的培养基置换完成的，在某些情况下，通过增加收获次数来提高最终慢病毒的质量。然而，在临床前及临床级大规模生产时，频繁收获是不现实的，因此在大多数时候只是收获 1-3 次。根据 10 叠层培养设备的数量及收获次数的多少，传统上采用 10-24 个 CF-10 设备一次生产周期可以收获的体积介于 20-52 升之间，基本上可以满足现在的 CAR-T 细胞治疗的病毒量需求。
采用悬浮培养生产慢病毒
虽然转染贴壁细胞是生产慢病毒的金标准方法，但是这个方法在扩大规模上受限。对工业化生产来说，在大的生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式。
在生物反应器中生产需要对悬浮的生产细胞扩大培养。多个用于生产慢病毒的细胞系 (293T、293FT、293SF-3F6) 被报道易于在化学成分限定的培养基中适应悬浮培养。这些细胞可以在没有贴壁载体的情况下迅速悬浮生长，这使得它们的培养和扩大比贴壁培养的细胞容易很多。此外，培养基中没有牛血清及其他动物来源的组分是临床生产最合适的情况，它可以降低被外源物质污染的风险。在悬浮培养模式下，细胞可以通过不同的容器进行扩大：摇瓶、玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器、培养袋及一次性搅拌容器。有报道采用 HEK293T 细胞进行扩增、转染、慢病毒生产可以用一次性的生物反应器实现 50L 的规模。
采用磷酸钙沉淀的 DNA 转染悬浮细胞由于持续的搅拌而被认为效率低下。因此，大多数时候采用其它的转染试剂如阳离子聚合物。线性 25kDa 的 PEI 可以在 293T 及 293-EBNA1 中诱导最高的转染效率，用 GFP 质粒作为报告质粒可以达到 75% 的转染效率。
总之，利用悬浮细胞瞬时转染大规模生产慢病毒是可行的，并且显示出良好的产量。但是，在转移到工业生产之前，该技术还需要进一步完善。优化的主要瓶颈是转染过程本身，它需要大量质粒 DNA，从而使生产过程极其昂贵。一种工业友好、减少 DNA 的消耗、提高生产细胞的百分比的转染技术是使这一过程在未来工业中有利可图的关键因素。
大规模慢病毒纯化
考虑到工业应用，在生物技术行业传统上使用的工艺步骤已经开发出用于慢病毒纯化技术，它们基本上都是是基于膜或色谱的技术。基于膜的技术如：过滤/澄清，利用切向流过滤进行浓缩/渗滤；基于色谱的技术如：离子交换色谱，亲和色谱，体积排阻色谱。这些不同的过程步骤的组合是可变的，在某些情况下，不同的净化原则可以用于相同的目的。原则上可以区分三个阶段:
I. 从粗病毒产品或澄清的细胞培养基中将靶分子捕获是纯化的第一步；
II. 中间纯化包括在捕获和优化阶段对澄清的粗产品进行的步骤，这些步骤去除特定的杂质；
III. 抛光是最后的步骤，目的是去除微量杂质和杂质，使活性和安全的产品以适合配方或包装的形式存在。在这一阶段的污染物往往是«构象»到目标分子，微量的杂质或疑似渗漏的产品. 实际上，任何类型的色谱和超滤都用于中间提纯和最后的抛光步骤。
报道的用于慢病毒下游处理的技术总结在 Table 3 中，各个研究团队之间最大的差异是靶分子捕获阶段，Scherr、Yamada 、 Slepushkin、Bellintani、Merten 、Greene 等证实可以用阴离子交换色谱来纯化 VSV-g 包被的慢病毒，而大规模纯化步骤是基于低压柱层析或基于膜的阴离子交换层析。当被用作第一步纯化时，这种膜盒可以最多每天纯化 1500L 样品。扩大规模可以直接获得纯的慢病毒 (如去掉超过 98% 污染的蛋白和 DNA)；然而，慢病毒的复性并不像超离那样高效。色谱基质的低回收率是由于 LV 脆性施加的限制性工艺条件所致。事实上，慢病毒对 pH 变化及高盐浓度非常敏感，而这两个指标正是离子交换色谱优化结合和洗脱脱条件经常改变的。
大多数操作规程的最后步骤是采用 0.2um 的膜过滤，这是在 GMP 条件下降低最终产品微生物污染风险的标准法规要求。虽然强烈推荐无菌过滤，但前提是该过程必须被证明是完全无菌的。这就需要无菌工艺验证，这是通过介质的工艺实验来完成，该操作必须在符合 Class100(美国) 或 Grade A(欧盟) 标准的环境内进行。
虽然过滤是保证产品无菌灌装前的最方便的方法，由 Oxford BioMedica 开发的下游处理工艺已经将该步骤放在第一个切向流过滤浓缩之后及最后一个切向流过滤步骤之前，从而降低因在慢病毒高浓度下被膜吸附而导致的丢失。
最后，有一个大规模纯化工艺没有最后的无菌过滤步骤，因为该生产工艺是在半封闭系统内完成的。在这种情况下，每个子批次都进行无菌检查，只有在无菌性得到验证后才进行集中。
结论及展望
慢病毒介导的基因递送技术，在基础科学研究和细胞治疗中已经显现出巨大的潜力。然而，慢病毒载体工业化生产工艺不成熟制约了其临床运用。我们也有理由相信，随着科学技术的发展和进步，将使这一有前途的载体系统造福于人类。
病毒载体选择
慢病毒载体
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体（RNA 类病毒）。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。慢病毒介导的基因过表达，可以实现目的基因在细胞内的长期稳定表达。
构建稳定细胞株的必选载体；
CAR-T 细胞治疗中主要使用的病毒载体；
病毒包装周期，2~3 周内完成；
慢病毒感染细胞多数需要 polybrene 辅助。
感染细胞后 2-~4 天后呈现表达丰度。
腺病毒
腺病毒载体（adenovirus）是以腺病毒为原型进行基因功能改造而成的，无外壳的双链 DNA 病毒，病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近 100% 的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达 11 次方；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。
基因瞬时表达选载体；
高浓度浓缩，可用于动物实验；
病毒包装周期：6~8 周；
腺病毒可以直接感染细胞无需 polybrene 辅助。
感染细胞后 24 H 后呈现表达丰度。
毒种可在 HEK293A 细胞中反复扩增。
腺相关病毒
腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。由于其安全性好、宿主细胞范围广 (分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长，具有明显的组织噬性等特点，这使 rAAV 成为用于基因转移和基因治疗的一个非常有吸引力的工具载体。
体内能长时间表达外源基因；
低免疫原性，良好的基因治疗载体；
较高的生物安全级别
病毒包装周期：6~8 周；
组织噬性——组织靶向！！！
AAV 组织噬性
AAV1：骨骼肌嗜性（包括心肌），神经组织也可以感染；
AAV2：有效转导肌肉，肝脏，脑组织，视网膜;
AAV5：视网膜、神经系统、关节滑膜嗜性、肺；
AAV8：肝嗜性，视网膜、神经组织也可以感染；
AAV9：心肌嗜性，可穿过血脑屏障；
AAV-DJ：广谱性侵染各种细胞，可做细胞实验。
慢病毒包装细胞
293T 细胞，慢病毒包装专用细胞，以及在此细胞基础上进行改造的可以提高病毒产量的细胞，如：293FT，293T-Fubio（复百澳专利细胞）等。
实验 KPI 点：
I. 尽量使用低代数的细胞用于病毒包装；
II. 无支原体等微生物污染；
III. 细胞传代后 24 H 用于病毒包装；
IV. 包装时细胞密度 80% 左右；
V. 转染后使用低浓度血清进行产毒培养。
补充知识： 293 细胞是转染了腺病毒 E1A 基因的人肾胚胎上皮系，293T 细胞由 293 细胞派生，同时表达 SV40 大 T 抗原，含有 SV40 复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T 细胞是亚三倍体人细胞系。染色体众数为 64，30% 的细胞有 64 条染色体。多数细胞 der⑴t（1;15）(q42;q13），der⒆t（3;19）(q12;q13），der⑿t（8;12）(q22;p13），还有四条标记染色体，有的细胞另有 5 条标记染色体。der⑴与 M8 (or Xq+）常常成对出现。N17 与 N22 各有四条。值得注意的是多数细胞有三条 X 染色体，两条 Xq+，一条 Xp+。
慢病毒包装质粒系统
目前，通用的慢病毒包装系统有三质粒和四质粒系统，四质粒系统在的安全性上更好点，而经典的三质粒系统的在操作性及病毒滴度上更胜一筹。
实验中的 KPI 点：
I. 转移质粒：包装质粒：包膜质粒的转染用量：3:1:1；
II. 包装质粒、包膜质粒质粒很重要，建议花点本钱用点好柱子抽提。基本要求无内毒素，260/280:1.80~1.90 之间，电泳条带清晰。
III. 转染效率质控（非常重要），转染后 24 H 细胞形态变圆（如图），48 H 后部分细胞脱落，如果无此现象，后续的病毒将很难获得高滴度。
补充知识：
三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中，包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 (VSVG)，应用 VSVG 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 (绿色荧光蛋白 GFP)。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性。通过三质粒共转染 293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达 10^9TU /ml。
四质粒表达系统, 为了减少 HIV 包装结构的序列同源性，进一步减少重组成 RCV 的可能性，Dull 等人将辅助基因去除。但由于 gag，pol 的转运需要 rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性。
科研级别慢病毒纯化
细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量，而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量，不同的实验室可根据自身的硬件条件及实验需求选择合适的纯化方案。
I. 超滤柱浓缩法
超滤浓缩分离技术，是根据分子的大小来分离溶液中大分子和小分子物质，超滤离心管通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂通过滤膜，而大分子溶质则被截留在样品管中。
基本流程：将含慢病毒上清液转移至超速离心管中，4℃ 离心 5000rpm*30 min，浓缩至 1 ml 或更少体积，收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，实验成本低，病毒纯度较差，毒性较高。
II. PEG 浓缩法
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种无电荷的线性分子结构的多糖，为乙二醇的聚合物，有较强的脱水作用，其能够破坏蛋白质分子表面的水化层而使蛋白发生沉淀，PEG 单独使用时非特异结合高，加入终浓度 0.5mol/L 的 NaCl 有助于病毒的沉淀。
基本流程：将含慢病毒上清液和 PEG8000（或者 4000,6000）按比例充分混合。4℃ 离心 5000rpm*20 min，用 1 mL 或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，浓缩至 1 ml 或更少体积。收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，操作简便，非特异结合，PEG 残留易至细胞融合甚至死亡。
III. 超速离心法
超速离心法是借助超速离心机根据物质的沉降系数，质量、密度等的不同，应用强大的离心力使病毒分离、浓缩和提纯的方法。
基本流程：将含慢病毒的上清液 10000rpm*10 min 除去细胞碎片，上清液用 0.22um 的滤膜过滤除菌后转移至超速离心管中，4℃ 离心 30000rpm*2 H，用 1 mL 或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，再用 0.22um 滤膜过滤除菌，用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求高，病毒纯度高，毒性小，病毒回收率相对较低。这种方法纯化的病毒市场价格相对较高。
大规模慢病毒制备
当转向临床实验时会需要大量的慢病毒载体，而将生产工艺放大则显得极为重要。本文着重介绍以下两种方式的大规模制备：贴壁细胞扩展法 (增加生产单元) 和悬浮细胞发酵法。
采用贴壁细胞大规模生产慢病毒
大多数大规模生产都是小规模生产的直接放大，即通过增加培养/生产单元来实现。生产基本上采用大量的多层培养系统 (Cell Factories(CF)(CF-10)(Figure 2)) 或者 Cell Stacks(CS)。因为易于操作，10 叠层装置 (CS-10) 可以考虑，虽然原则上 40 叠层装置同样也可以用，但是因为它重量增加的原因所以需要特殊的处理系统。此外，每层平板的气体交换及培养基层不可能一致，因此用显微镜控制 40 叠层装置细胞的生长很困难。生产要么采用放在层流工作台的开放模式，要么采用半封闭模式，后者对操作人员、环境及终产品的安全性更高。
收获是通过简单的培养基置换完成的，在某些情况下，通过增加收获次数来提高最终慢病毒的质量。然而，在临床前及临床级大规模生产时，频繁收获是不现实的，因此在大多数时候只是收获 1-3 次。根据 10 叠层培养设备的数量及收获次数的多少，传统上采用 10-24 个 CF-10 设备一次生产周期可以收获的体积介于 20-52 升之间，基本上可以满足现在的 CAR-T 细胞治疗的病毒量需求。
采用悬浮培养生产慢病毒
虽然转染贴壁细胞是生产慢病毒的金标准方法，但是这个方法在扩大规模上受限。对工业化生产来说，在大的生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式。
在生物反应器中生产需要对悬浮的生产细胞扩大培养。多个用于生产慢病毒的细胞系 (293T、293FT、293SF-3F6) 被报道易于在化学成分限定的培养基中适应悬浮培养。这些细胞可以在没有贴壁载体的情况下迅速悬浮生长，这使得它们的培养和扩大比贴壁培养的细胞容易很多。此外，培养基中没有牛血清及其他动物来源的组分是临床生产最合适的情况，它可以降低被外源物质污染的风险。在悬浮培养模式下，细胞可以通过不同的容器进行扩大：摇瓶、玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器、培养袋及一次性搅拌容器。有报道采用 HEK293T 细胞进行扩增、转染、慢病毒生产可以用一次性的生物反应器实现 50L 的规模。
采用磷酸钙沉淀的 DNA 转染悬浮细胞由于持续的搅拌而被认为效率低下。因此，大多数时候采用其它的转染试剂如阳离子聚合物。线性 25kDa 的 PEI 可以在 293T 及 293-EBNA1 中诱导最高的转染效率，用 GFP 质粒作为报告质粒可以达到 75% 的转染效率。
总之，利用悬浮细胞瞬时转染大规模生产慢病毒是可行的，并且显示出良好的产量。但是，在转移到工业生产之前，该技术还需要进一步完善。优化的主要瓶颈是转染过程本身，它需要大量质粒 DNA，从而使生产过程极其昂贵。一种工业友好、减少 DNA 的消耗、提高生产细胞的百分比的转染技术是使这一过程在未来工业中有利可图的关键因素。
大规模慢病毒纯化
考虑到工业应用，在生物技术行业传统上使用的工艺步骤已经开发出用于慢病毒纯化技术，它们基本上都是是基于膜或色谱的技术。基于膜的技术如：过滤/澄清，利用切向流过滤进行浓缩/渗滤；基于色谱的技术如：离子交换色谱，亲和色谱，体积排阻色谱。这些不同的过程步骤的组合是可变的，在某些情况下，不同的净化原则可以用于相同的目的。原则上可以区分三个阶段:
I. 从粗病毒产品或澄清的细胞培养基中将靶分子捕获是纯化的第一步；
II. 中间纯化包括在捕获和优化阶段对澄清的粗产品进行的步骤，这些步骤去除特定的杂质；
III. 抛光是最后的步骤，目的是去除微量杂质和杂质，使活性和安全的产品以适合配方或包装的形式存在。在这一阶段的污染物往往是«构象»到目标分子，微量的杂质或疑似渗漏的产品. 实际上，任何类型的色谱和超滤都用于中间提纯和最后的抛光步骤。
报道的用于慢病毒下游处理的技术总结在 Table 3 中，各个研究团队之间最大的差异是靶分子捕获阶段，Scherr、Yamada 、 Slepushkin、Bellintani、Merten 、Greene 等证实可以用阴离子交换色谱来纯化 VSV-g 包被的慢病毒，而大规模纯化步骤是基于低压柱层析或基于膜的阴离子交换层析。当被用作第一步纯化时，这种膜盒可以最多每天纯化 1500L 样品。扩大规模可以直接获得纯的慢病毒 (如去掉超过 98% 污染的蛋白和 DNA)；然而，慢病毒的复性并不像超离那样高效。色谱基质的低回收率是由于 LV 脆性施加的限制性工艺条件所致。事实上，慢病毒对 pH 变化及高盐浓度非常敏感，而这两个指标正是离子交换色谱优化结合和洗脱脱条件经常改变的。
大多数操作规程的最后步骤是采用 0.2um 的膜过滤，这是在 GMP 条件下降低最终产品微生物污染风险的标准法规要求。虽然强烈推荐无菌过滤，但前提是该过程必须被证明是完全无菌的。这就需要无菌工艺验证，这是通过介质的工艺实验来完成，该操作必须在符合 Class100(美国) 或 Grade A(欧盟) 标准的环境内进行。
虽然过滤是保证产品无菌灌装前的最方便的方法，由 Oxford BioMedica 开发的下游处理工艺已经将该步骤放在第一个切向流过滤浓缩之后及最后一个切向流过滤步骤之前，从而降低因在慢病毒高浓度下被膜吸附而导致的丢失。
最后，有一个大规模纯化工艺没有最后的无菌过滤步骤，因为该生产工艺是在半封闭系统内完成的。在这种情况下，每个子批次都进行无菌检查，只有在无菌性得到验证后才进行集中。
结论及展望
慢病毒介导的基因递送技术，在基础科学研究和细胞治疗中已经显现出巨大的潜力。然而，慢病毒载体工业化生产工艺不成熟制约了其临床运用。我们也有理由相信，随着科学技术的发展和进步，将使这一有前途的载体系统造福于人类。