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一文掌握病毒包装、纯化及使用
人阅读 发布时间：2018-05-21 09:26
生物狗们常常被实验所虐，当然也包括病毒实验咯！百澳笑笑生，今天就慢病毒包装、纯化和使用方面的问题和大伙聊个五毛钱的！
§ 病毒包装细胞
293T 细胞，慢病毒包装专用细胞，以及在此细胞基础上进行改造的可以提高病毒产量的细胞，如：293FT，293T-Fubio（复百澳专利细胞）等。
实验 KPI 点：
I. 尽量使用低代数的细胞用于病毒包装；
II. 无支原体等微生物污染；
III. 细胞传代后 24H 用于病毒包装；
IV. 包装时细胞密度 80% 左右；
V. 质粒转染后的细胞使用低血清浓度进行产毒培养。
补充知识： 293 细胞是转染了腺病毒 E1A 基因的人肾胚胎上皮系，293T 细胞由 293 细胞派生，同时表达 SV40 大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T 细胞是亚三倍体人细胞系。染色体众数为 64，30% 的细胞有 64 条染色体。多数细胞 der⑴t（1;15） (q42;q13），der⒆t（3;19） (q12;q13），der⑿t（8;12） (q22;p13），还有四条标记染色体，有的细胞另有 5 条标记染色体。der⑴ 与 M8 (or Xq+）常常成对出现。N17 与 N22 各有四条。值得注意的是多数细胞有三条X染色体，两条 Xq+，一条 Xp+。
§ 病毒包装质粒系统
目前，通用的慢病毒包装系统有三质粒和四质粒系统，四质粒系统在的安全性上更好点，而经典的三质粒系统的在操作性及病毒滴度上更胜一筹。
实验中的 KPI 点：
I. 转移质粒：包装质粒：包膜质粒的转染用量：3:1:1；
II. 包装质粒、包膜质粒质粒很重要，建议花点本钱用点好柱子抽提。基本要求无内毒素，260/280:1.80~1.90之间，电泳条带清晰。
§ 转染效率质控（非常重要），转染后24H细胞形态变圆（如图），48H后部分细胞脱落，如果无此现象，后续的病毒将很难获得高滴度。
补充知识：三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中，包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达HIV复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白(VSVG)，应用 VSVG包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 (绿色荧光蛋白 GFP)。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性。通过三质粒共转染 293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达 10^9TU /ml。
四质粒表达系统，为了减少 HIV 包装结构的序列同源性，进一步减少重组成 RCV 的可能性，Dull 等人将辅助基因去除。但由于 gag，pol 的转运需要 rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性。
§ 病毒纯化
细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量，而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量，不同的实验室可根据自身的硬件条件及实验需求选择合适的纯化方案，病毒服务市场的价格多取决于病毒的纯化方法。
I. 超滤柱浓缩法
超滤浓缩分离技术，是根据分子的大小来分离溶液中大分子和小分子物质，超滤离心管通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂通过滤膜，而大分子溶质则被截留在样品管中。
基本流程：将含慢病毒上清液转移至超速离心管中，4℃离心5000rpm*30min，浓缩至1ml或更少体积，收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，实验成本低，病毒纯度较差，毒性较高。
II. PEG浓缩法
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种无电荷的线性分子结构的多糖，为乙二醇的聚合物，有较强的脱水作用，其能够破坏蛋白质分子表面的水化层而使蛋白发生沉淀，PEG 单独使用时非特异结合高，加入终浓度0.5mol/L的NaCl有助于病毒的沉淀。
基本流程：将含慢病毒上清液和PEG8000（或者4000,6000）按比例充分混合。4℃离心5000rpm*20min，用1mL或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，浓缩至1ml或更少体积。收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，操作简便，非特异结合，PEG残留易至细胞融合甚至死亡。
III. 超速离心法（复百澳使用的纯化方法）
超速离心法是借助超速离心机根据物质的沉降系数，质量、密度等的不同，应用强大的离心力使病毒分离、浓缩和提纯的方法。
基本流程：将含慢病毒的上清液10000rpm*10min除去细胞碎片，上清液用0.22um的滤膜过滤除菌后转移至超速离心管中，4℃离心50000rpm*2H，用1mL或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，再用0.22um滤膜过滤除菌，用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求高，病毒纯度高，毒性小，病毒回收率相对较低。这种方法纯化的病毒市场价格相对较高。
IV. 纯化柱纯化法
慢病毒纯化柱法是通过离子柱来吸附慢病毒颗粒，再用洗脱液进行洗脱的方法纯化病毒，所得的病毒纯度高，但实验的成本也较高，对于常规的实验而言性价比较低。
§ 慢病毒感染
慢病毒可以有效的感染神经元细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞，可以实现目的基因在细胞内的长期稳定表达。但是，不同细胞的感染效率差异较大，多数细胞需要有 Polybrene 或其他助感染试剂的辅助（如:复百澳 LV-Enhance ^TM）。
实验中的 KPI 点：
I. 慢病毒 4℃ 融化，忌反复冻融；
II. 细胞传代 24H~48H 内进行病毒感染；
III. 不同细胞需要摸索合适的 MOI 值。
IV. 感染时需要配套使用助感染试剂；
V. 细胞感染病毒后 8-12H 内需要换液；
附. 部分细胞 MOI 列表（www.fubio.cn）
§ 病毒包装细胞
293T 细胞，慢病毒包装专用细胞，以及在此细胞基础上进行改造的可以提高病毒产量的细胞，如：293FT，293T-Fubio（复百澳专利细胞）等。
实验 KPI 点：
I. 尽量使用低代数的细胞用于病毒包装；
II. 无支原体等微生物污染；
III. 细胞传代后 24H 用于病毒包装；
IV. 包装时细胞密度 80% 左右；
V. 质粒转染后的细胞使用低血清浓度进行产毒培养。
补充知识： 293 细胞是转染了腺病毒 E1A 基因的人肾胚胎上皮系，293T 细胞由 293 细胞派生，同时表达 SV40 大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T 细胞是亚三倍体人细胞系。染色体众数为 64，30% 的细胞有 64 条染色体。多数细胞 der⑴t（1;15） (q42;q13），der⒆t（3;19） (q12;q13），der⑿t（8;12） (q22;p13），还有四条标记染色体，有的细胞另有 5 条标记染色体。der⑴ 与 M8 (or Xq+）常常成对出现。N17 与 N22 各有四条。值得注意的是多数细胞有三条X染色体，两条 Xq+，一条 Xp+。
§ 病毒包装质粒系统
目前，通用的慢病毒包装系统有三质粒和四质粒系统，四质粒系统在的安全性上更好点，而经典的三质粒系统的在操作性及病毒滴度上更胜一筹。
实验中的 KPI 点：
I. 转移质粒：包装质粒：包膜质粒的转染用量：3:1:1；
II. 包装质粒、包膜质粒质粒很重要，建议花点本钱用点好柱子抽提。基本要求无内毒素，260/280:1.80~1.90之间，电泳条带清晰。
§ 转染效率质控（非常重要），转染后24H细胞形态变圆（如图），48H后部分细胞脱落，如果无此现象，后续的病毒将很难获得高滴度。
补充知识：三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中，包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达HIV复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白(VSVG)，应用 VSVG包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 (绿色荧光蛋白 GFP)。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性。通过三质粒共转染 293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达 10^9TU /ml。
四质粒表达系统，为了减少 HIV 包装结构的序列同源性，进一步减少重组成 RCV 的可能性，Dull 等人将辅助基因去除。但由于 gag，pol 的转运需要 rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性。
§ 病毒纯化
细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量，而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量，不同的实验室可根据自身的硬件条件及实验需求选择合适的纯化方案，病毒服务市场的价格多取决于病毒的纯化方法。
I. 超滤柱浓缩法
超滤浓缩分离技术，是根据分子的大小来分离溶液中大分子和小分子物质，超滤离心管通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂通过滤膜，而大分子溶质则被截留在样品管中。
基本流程：将含慢病毒上清液转移至超速离心管中，4℃离心5000rpm*30min，浓缩至1ml或更少体积，收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，实验成本低，病毒纯度较差，毒性较高。
II. PEG浓缩法
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种无电荷的线性分子结构的多糖，为乙二醇的聚合物，有较强的脱水作用，其能够破坏蛋白质分子表面的水化层而使蛋白发生沉淀，PEG 单独使用时非特异结合高，加入终浓度0.5mol/L的NaCl有助于病毒的沉淀。
基本流程：将含慢病毒上清液和PEG8000（或者4000,6000）按比例充分混合。4℃离心5000rpm*20min，用1mL或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，浓缩至1ml或更少体积。收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，操作简便，非特异结合，PEG残留易至细胞融合甚至死亡。
III. 超速离心法（复百澳使用的纯化方法）
超速离心法是借助超速离心机根据物质的沉降系数，质量、密度等的不同，应用强大的离心力使病毒分离、浓缩和提纯的方法。
基本流程：将含慢病毒的上清液10000rpm*10min除去细胞碎片，上清液用0.22um的滤膜过滤除菌后转移至超速离心管中，4℃离心50000rpm*2H，用1mL或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，再用0.22um滤膜过滤除菌，用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求高，病毒纯度高，毒性小，病毒回收率相对较低。这种方法纯化的病毒市场价格相对较高。
IV. 纯化柱纯化法
慢病毒纯化柱法是通过离子柱来吸附慢病毒颗粒，再用洗脱液进行洗脱的方法纯化病毒，所得的病毒纯度高，但实验的成本也较高，对于常规的实验而言性价比较低。
§ 慢病毒感染
慢病毒可以有效的感染神经元细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞，可以实现目的基因在细胞内的长期稳定表达。但是，不同细胞的感染效率差异较大，多数细胞需要有 Polybrene 或其他助感染试剂的辅助（如:复百澳 LV-Enhance ^TM）。
实验中的 KPI 点：
I. 慢病毒 4℃ 融化，忌反复冻融；
II. 细胞传代 24H~48H 内进行病毒感染；
III. 不同细胞需要摸索合适的 MOI 值。
IV. 感染时需要配套使用助感染试剂；
V. 细胞感染病毒后 8-12H 内需要换液；
附. 部分细胞 MOI 列表（www.fubio.cn）
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