一文带你了解基因治疗中的明星载体腺相关病毒（AAV）

重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)属于细小病毒科，为无包膜、单链DNA病毒，基因组约4.7 kb。重组 AAV（rAAV）已被设计用于增强特异性，并被开发为治疗各种疾病的工具。七种基于rAAV的基因治疗产品已获得监管部门的批准，但仍存在免疫原性和不良反应等问题。本篇综述探讨了AAV生物学，重点是当前的载体工程策略和制造技术。研究者们讨论了如何在正在进行的眼部、神经、代谢、血液、神经肌肉和心血管疾病以及癌症的临床试验中使用 rAAV。同时概述了由rAAV引发的免疫反应，解决了相关的副作用，并讨论了减轻这些反应的策略。

Figure 1. Schematic of the AAV genome and sites used for PCR screening.

截至目前，共有14种体外基因疗法和29种体内基因疗法主要通过FDA获得批准。

Figure 2. Approved gene therapy products and delivery platforms.

人类血清阳性率研究表明，很大一部分人群拥有针对多种 AAV 血清型的中和抗体（NAb）。针对健康志愿者的888份人类血清样本的研究发现，针对AAV2的 NAb 最为普遍，其次是 AAV1、AAV7 和 AAV8。另一项研究表明，来自552 份人类样本的血清中NAb分别是AAV1（74.9%）、AAV6（70.1%）、AAV5（63.9%）、AAV8（60.4%）和AAV9（57.8%）。

在过去的二十年中，已经鉴定出至少12种AAV血清型和1000多种变体。这些血清型对各种细胞或组织具有不同的趋向性（Table 1）。AAV血清型之间的基因组差异主要在于病毒衣壳序列的可变区域，特别是VP3在决定嗜性方面起着至关重要的作用。

Table 1. Summary of natural AAV receptors and tissue specificity in humans

rAAV 衣壳序列和基因组 DNA 货物（包括启动子、转基因、增强子和 ITR）都在紧张研究中。衣壳工程是开发针对不同临床应用量身定制的 rAAV 的主要策略。它主要包括三种方法：使用高通量测序，可以从人类和非人灵长类组织中分离出天然存在的AAV变异体；合理设计利用AAV生物学知识修饰AAV衣壳中的相关氨基酸，以增强转导能力或逃避免疫监视；定向进化是一种工程方法，用于开发具有指定特异性的新型 AAV 变体；计算机模拟方法利用已知的衣壳序列来重建原始的AAV序列，使用基因组已突变的AAV转导的大型样本数据集预测AAV基因组中特定序列与包装能力和组织趋向性之间的关系（Fig.3）。

Figure 3. Strategies applied for the development of novel AAV variants. 

Figure 4. Current approaches to manufacture rAAV. 

rAAV在一系列重大人类疾病中的临床应用，包括眼部、神经、代谢、血液、神经肌肉、心血管疾病和肿瘤学。

Figure 5. Current clinical applications of rAAV in major human diseases.

除了物理屏障外，rAAV还会遇到免疫系统建立的许多生物屏障，包括预先存在的免疫、补体激活、先天免疫受体以及适应性B细胞和T细胞免疫（Fig.5）。

a）预先存在的AAV特异性抗体可以与rAAV相互作用并阻断其靶细胞进入。细菌来源的肽内切酶 IdeS及其同源物能将完整的抗体切割成Fab和Fc片段，或者衣壳可以被EV修饰或封装以防止抗体识别。

b）给予高剂量的rAAV时观察到补体激活。粘附在细胞表面的rAAV 通过与补体C1qs结合来激活经典途径，补体C1qs切割C4和C2形成C3转化酶C4b2b，然后 C3被切割并形成C5转化酶，该转化酶将C5裂解成C5b，C5b与C6-9 结合形成直接导致细胞裂解的膜攻击复合物（MAC）， 导致肝脏或肾脏损伤。环肽APL-9（C1抑制剂，C1inh），依库珠单抗（C1、C3和C5抑制剂），可抑制补体激活级联反应。

d）适应性免疫是指抗原特异性B细胞和T细胞反应。B细胞可以产生靶向rAAV衣壳的抗体，从而消除重新给药的可能性。细胞毒性CD8+ T细胞可以识别来自转基因和rAAV衣壳的外源肽，并启动转导细胞的杀伤。

转基因的miRNA结合位点可以与细胞miRNA相互作用，导致转录降解。在抗原呈递细胞中，这种设计可能会阻止转基因衍生肽呈递给T细胞。此外，抗CD20抗体利妥昔和mTOR抑制剂雷帕霉素可用于减少适应性反应。

Figure 6. Immune responses in rAAV-based gene therapy.