嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫效应细胞（CAR-T/NK）疗法是近年来发展迅猛、备受期待的肿瘤过继疗法。其中CAR-T疗法作为临床免疫治疗的里程碑式成果针对淋巴瘤等血液系统肿瘤治疗效果显著。截止目前，全球共有11个CAR-T细胞疗法产品获批上市，国内已有5款产品获批。然而对于实体瘤，受限于多种免疫抑制机制，CAR-T疗法较为疲软。

 

自然杀伤（NK）细胞被认为是修饰T细胞的替代品，其表达的PD-1水平较低，几乎不会引起免疫抑制。NK细胞能够促进树突状细胞向肿瘤的迁移，从而增强抗PD-1/PD-L1/CTLA4免疫治疗的效果。这使得CAR-NK疗法在实体瘤方向有巨大的应用潜力。

 

CAR-NK靶点选择

 

选择正确的靶点应满足其抗原在肿瘤组织上过表达，在正常细胞上无表达或低表达，同时具有能够被CAR-NK细胞准确识别的细胞膜定位。

 

CAR靶点可分为四类：肿瘤特异性抗原（TSA）、肿瘤相关抗原（TAA）、癌症相关基质细胞（CASC）表面抗原和糖脂抗原，其中恶性血液瘤常用CD19、B细胞成熟抗原（BCMA）和CD33靶点，而实体瘤常用MSLN、GD2、HER2、癌胚抗原（CEA）、GPC3和EGFRvIII靶点。

 

NK细胞疗法选择靶向抗原的关键在于根据应用瘤种，找到一种具有更好安全性、特异性和有效性的抗原。

 

CAR-NK细胞的设计构建

 

CAR是CAR-NK细胞的核心组成，通常由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域三部分结构。基于细胞内激活结构域，CAR载体设计已拓新至第五代。

 

第一代CAR仅包含用于靶向细胞膜抗原的scFv抗体和用于活化效应细胞的CD3ζ信号抗原识别域。

 

在原有细胞内信号区基础上衍生了第二、三代CAR，将CD28、OX-40、4-1BB等一个或两个共刺激信号元件串联起来。第二代CAR可提高NK细胞的细胞毒性、增殖活性和存活时间，增加抗原诱导的细胞因子的释放，上调抗凋亡蛋白，增强抗肿瘤作用。第三代CAR进一步改善了信号转导功能，使CAR-NK细胞具有更强的体内扩增能力和更长的持久性。

 

第四代CAR又称TRUCK，引入了细胞因子和共刺激配体等，能够形成有效的二级信号并被免疫系统识别，进一步放大了抗肿瘤免疫作用，延长了体内细胞的存活时间，增强了相关免疫细胞的杀伤能力，有效地降低了毒性和副作用，变得更加可控。

 

第五代CAR基于二代结构，包含了一个截短的细胞质IL-2受体β链结构域，具有转录因子STAT3结合位点。受体的抗原特异性激活TCR（通过CD3ζ）、共刺激（CD28）和细胞因子（JAK-STAT3/5）信号，有效地提供了三种必要的协同信号来驱动T细胞活化和增殖

 

 

由于NK细胞具有特异的激活和抑制受体来控制细胞活化和毒性，使用NK特异性细胞内信号转导结构域（如接头分子DAP10）或含ITAM的信号转导结构域（如DAP12和2B4）可改善细胞毒性。与含有4-1BB-CD3ζ的CAR-NK细胞相比，含有2B4-CD3ζ的CAR-NK细胞更利于干扰素γ的产生，具有更好的体内抗肿瘤功效。

 

CAR-NK疗法的优势与挑战

 

NK细胞是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，可以对非自身细胞产生快速反应。与识别MHC上呈递的抗原的T细胞不同，NK细胞可以在没有MHC的情况下直接识别靶细胞。

 

优势一

 

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞优势之一在于免疫细胞来源，无需自体NK细胞，使用现有的NK92细胞系、脐带血和诱导多能干细胞（iPSC），可大规模生产即用型CAR-NK细胞，随时输注给患者。同时临床试验表明无需担心同种异体反应性和移植物抗宿主病（GVHD）效应。

优势二

 

CAR-NK疗法不会引起细胞因子释放综合症（CRS）和神经毒性。NK细胞活化后释放的细胞因子谱系区别于T细胞释放的炎性细胞因子，不会造成高级别的神经毒性。

优势三

 

NK细胞有多种靶向和抗肿瘤机制，如CD16可以识别与肿瘤结合的lgG的Fc部分并杀死癌细胞；NK细胞可以通过结合细胞表面受体KIRs激活并杀死癌细胞。

优势四

 

NK细胞体内存活周期短，不易产生长期不良反应，在脱靶情况下可在短期内自我清除。

 

目前CAR-NK疗法在技术上亟待解决的是原代NK细胞在体外如何快速扩增，如何提高转染效率，由于半衰期短，如何在体内达到持久治疗效果。

 

免疫联合疗法应用策略

 

近年来CAR-NK疗法在肿瘤免疫治疗中临床应用显示巨大潜力。然而在应用中肿瘤免疫抑制微环境和NK细胞受体/配体组谱转移抑制了本身功能。根据不同肿瘤类型和不同患者的个体特征，合理有效地将CAR-NK细胞疗法与其他免疫治疗方法、放化疗结合，重塑肿瘤微环境或纠正NK细胞受体/配体组谱的偏差，不仅可以提高CAR-NK细胞的抗肿瘤活性，还可以增强肿瘤细胞的敏感性，从而达到更好的治疗效果。

 

 

 

（1）基于NK受体/配体位移校正的联合免疫策略

肿瘤免疫微环境会改变NK细胞受配体的表达，降低活化效率，导致NK细胞耗竭，促进肿瘤免疫逃避。免疫检查点阻断疗法如CTLA-4、PD-1/L1单抗与CAR-NK疗法联合，可有效克服肿瘤免疫逃避，逆转CAR-NK细胞功能耗竭并增强细胞毒性。

 

（2）联合放化疗提高CAR-NK细胞的抗肿瘤活性

放化疗抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡的同时，还可以调节NK细胞受体/配体的表达，增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤的敏感性。为降低常规静脉化疗的毒副作用，有研究利用NK细胞作为靶向载体将抗肿瘤药物直接递送至原位肿瘤，发挥联合作用。

 

（3）联合多种激酶抑制剂调节TME，促进抗肿瘤免疫

研究表明酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）不仅具有直接抗肿瘤活性，还能调节肿瘤微环境，促进抗肿瘤免疫。联合CAR-NK疗法为治疗实体瘤提供全新策略。

 

（4）联合蛋白酶体抑制剂增强CAR-NK细胞功能

研究表明蛋白酶体抑制剂可通过增强NK细胞的功能或增强肿瘤细胞对杀伤的敏感度来直接或间接抑制肿瘤。

 

（5）联合STING激动剂激活CAR-NK细胞STING通路，增强抗肿瘤活性

干扰素基因刺激因子（STING）激动剂可通过激活NK细胞、上调NK细胞活化受体的表达、下调NK细胞抑制受体的表达来增强NK细胞的抗肿瘤活性。

 

（6）联合溶瘤病毒，重塑TME，增强抗肿瘤免疫

溶瘤病毒可以在侵染肿瘤细胞的同时将其裂解，并通过释放抗原和激活肿瘤微环境中的炎症反应间接增强抗肿瘤免疫。多项研究表示与CAR-NK疗法协同可抑制肿瘤生长，显著提高生存率。

 

（7）结合光热疗法释放抗原，促进内源性免疫细胞招募

肿瘤的轻度热疗可以降低其致密结构和间质液压力，增加血液灌注，释放抗原，促进内源性免疫细胞的募集。因此，轻度热疗与CAR细胞的过继转移相结合，可能会提高这些细胞在实体瘤中的治疗效果。

 

总  结

 

CAR-NK在肿瘤免疫治疗特别是实体瘤方向，无论是临床前和临床研究，迫切需要开发更有效的感染和更安全的非病毒转染技术，克服抑制性肿瘤微环境这一挑战，不断积累临床经验。与其他抗肿瘤疗法联合应用将是未来肿瘤治疗的主要方向。

 

参考文献：

[1] Pan K, Farrukh H, Chittepu VCSR, Xu H, Pan CX, Zhu Z. CAR race to cancer immunotherapy: from CAR T, CAR NK to CAR macrophage therapy. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 31;41(1):119.

[2] Li J, Hu H, Lian K, Zhang D, Hu P, He Z, Zhang Z, Wang Y. CAR-NK cells in combination therapy against cancer: A potential paradigm. Heliyon. 2024 Feb 29;10(5):e27196.

[3] Wang, W., Liu, Y., He, Z. et al. Breakthrough of solid tumor treatment: CAR-NK immunotherapy. Cell Death Discov. 10, 40 (2024).