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重组腺病毒（AdV）
人阅读 发布时间：2019-12-23 12:03
重组腺病毒（AdV）是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒 5 型（Ad5），其基因组是 36 kb 长的线性双链 DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。
重组腺病毒具有以下几个显著优点：
感染范围广，几乎可以感染所有的分裂和不分裂细胞系、原代细胞和部分组织；
感染效率高达 100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；
对外源基因容载能力大（可以高达 8 Kb）；
不整合基因组；
滴度高，操作方便。
因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。
重组腺病毒包装系统：
1、AdEasy 系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。在 AdEasyTM 载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性 DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒 DNA 操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因 cDNA 插入一个转移载体，将得到的质粒用 PmeI 线性化，然后在大肠杆菌 BJ5183 中与病毒 DNA 质粒 pAdEasy-1 进行同源重组。pAdEasy-1 缺失了 E1 和 E3 区，其 E1 区功能将在 293A 细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用 PmeI 线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），转染 293A 细胞后产生重组病毒颗粒。 同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌 BJ5183 有 recA 活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无 recA、endA 活性的细菌株如 DH5α等进行扩增。由于缺乏 recA 活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。
2、AdMAX 系统，通过 Cre-loxp 重组酶，使共转染到 HEK293 细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生重组腺病毒，获得的病毒滴度更高。
重组腺病毒包装过程：
无论是 AdEasy 还是 AdMAX 系统，都需要使用 293A 细胞进行包装，293A 细胞提供腺病毒扩增所需的 E1A 元件。
操作步骤：
1、接种 293A 细胞于 T25 细胞培养瓶，使用时密度 20%-30% 左右即可。
2、细胞接种 24 小时左右转染腺病毒包装所需质粒。
3、转染后 24 小时，观察转染效率进行确认转染是否成功。
4、转染成功后等待 CPE 出现（7-20 天），等待过程中根据细胞情况换液
5、细胞出现 CPE 后，等细胞脱落 60% 左右将细胞收集低速离心。
6、将收集的细胞用适量 PBS 吹散，在-80℃ 和 37℃ 之间，来回冻融 3-4 次。
7、将冻融后的细胞悬液低速离心，离心后使用。022um 滤膜将上清过滤，标记为 P0 代毒种。
8、准备 1-2 皿细胞，使用时细胞密度 90% 左右，接种 P0 代毒种，扩增 P1 代毒种。
9、步骤同 5-7，标记为 P1 代毒种。
10、后续扩增根据实验需要，进行适量选择。
CPE
重组腺病毒载体纯化：
1、氯化铯纯化：通过铺设氯化铯不同浓度对腺病毒进行纯化。
2、离子层析纯化：通过腺病毒的电荷性质，对腺病毒载体进行纯化，纯度高。
重组腺病毒具有以下几个显著优点：
感染范围广，几乎可以感染所有的分裂和不分裂细胞系、原代细胞和部分组织；
感染效率高达 100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；
对外源基因容载能力大（可以高达 8 Kb）；
不整合基因组；
滴度高，操作方便。
因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。
重组腺病毒包装系统：
1、AdEasy 系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。在 AdEasyTM 载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性 DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒 DNA 操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因 cDNA 插入一个转移载体，将得到的质粒用 PmeI 线性化，然后在大肠杆菌 BJ5183 中与病毒 DNA 质粒 pAdEasy-1 进行同源重组。pAdEasy-1 缺失了 E1 和 E3 区，其 E1 区功能将在 293A 细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用 PmeI 线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），转染 293A 细胞后产生重组病毒颗粒。 同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌 BJ5183 有 recA 活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无 recA、endA 活性的细菌株如 DH5α等进行扩增。由于缺乏 recA 活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。
2、AdMAX 系统，通过 Cre-loxp 重组酶，使共转染到 HEK293 细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生重组腺病毒，获得的病毒滴度更高。
重组腺病毒包装过程：
无论是 AdEasy 还是 AdMAX 系统，都需要使用 293A 细胞进行包装，293A 细胞提供腺病毒扩增所需的 E1A 元件。
操作步骤：
1、接种 293A 细胞于 T25 细胞培养瓶，使用时密度 20%-30% 左右即可。
2、细胞接种 24 小时左右转染腺病毒包装所需质粒。
3、转染后 24 小时，观察转染效率进行确认转染是否成功。
4、转染成功后等待 CPE 出现（7-20 天），等待过程中根据细胞情况换液
5、细胞出现 CPE 后，等细胞脱落 60% 左右将细胞收集低速离心。
6、将收集的细胞用适量 PBS 吹散，在-80℃ 和 37℃ 之间，来回冻融 3-4 次。
7、将冻融后的细胞悬液低速离心，离心后使用。022um 滤膜将上清过滤，标记为 P0 代毒种。
8、准备 1-2 皿细胞，使用时细胞密度 90% 左右，接种 P0 代毒种，扩增 P1 代毒种。
9、步骤同 5-7，标记为 P1 代毒种。
10、后续扩增根据实验需要，进行适量选择。
CPE
重组腺病毒载体纯化：
1、氯化铯纯化：通过铺设氯化铯不同浓度对腺病毒进行纯化。
2、离子层析纯化：通过腺病毒的电荷性质，对腺病毒载体进行纯化，纯度高。
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