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高效转导! 满屏绿油油……

发布时间:2018-03-26 08:45 |  点击次数:

新学年伊始,恭喜又有一批有志青年进入了实验室,为人类的健康事业挥洒着自己的青春,成为了生物狗!

基因转导技术是生物学实验基础入门技术之一,基因导入细胞的效率将决定着生物狗们的实验幸福指数,伴随着狗狗们整个实验生活。

Part 1. 基础概念区分 

刚进实验室小伙伴们常被这两组词绕得一脸懵逼——“转染”和“感染”、“瞬转”和“稳转”那么这两组词到底啥意思呢?

  • “转染”和“感染”

在细胞生物学实验中,DNA或RNA进入细胞的常规方式有两种,一种是通过物理或化学的方式进入细胞体内,一种是借助于病毒载体的方式进入细胞体内。通过物理或化学的方式将DNA或RNA导入细胞体内的过程称之为转染如电转和磷酸钙转染等通过病毒载体的方式将DNA或RNA导入细胞体内的过程称之为感染如腺病毒感染和慢病毒感染

 

  • “瞬转”和“稳转”

 瞬转,是经过转染试剂或病毒载体的作用,将外源核酸分子导入细胞内进行表达,但是导入的核酸不整合到宿主细胞基因组中,因此它只会短暂地存在于宿主细胞中不会随着细胞的分裂而进入到子代细胞中。表达时间大概最长大概为1周左右,一般48-96小时进行后续实验或检测项目

稳转,将核酸外源分子导入细胞内,并整合到细胞基因组中,子代细胞稳定表达转入的外源核酸分子。与瞬时转染不同,稳定转染允许外源DNA在转染的细胞及其后代中的长期维持。通常是将单拷贝或多个拷贝的外源DNA整合到细胞的基因组中,外源分子的表达水平一般低于瞬时转染的表达水平。

瞬转和稳转的比较
一“图”以蔽之,直观简单区分“转染”和“感染”、“瞬转”和“稳转”(示意图)。

 

 

Part 2. 基因转导方法 

基因转导,是用物理的、化学的或生物学的方法将目的基因导入受体细胞并使之表达的一种技术基因转导大概分为化学方法、物理方法和生物方法

化学方法---利用化学试剂辅助形成转染复合物,通过膜融合或胞吞的方式进入细胞内;

物理方法---利用电流或其他方式在细胞膜表面产生一个瞬时的孔将DNA导入细胞内;

生物方法---利用基因工程病毒载体感染细胞,将外源DNA导入细胞内。

  • 磷酸钙介导的转染

将DNA与氯化钙在磷酸缓冲盐水中混合形成磷酸钙-DNA沉淀物,然后将其分散在培养的细胞上,共沉淀物与细胞表面的结合,DNA通过内吞作用进入细胞

 

 

  • 阳离子脂质体介导的转染

阳离子脂质体介导的转染是目前最常用的转染方式之一,正电荷的脂类和中性辅助脂类等摩尔混合。阳性电荷的脂质体与带阴性电荷的DNA之间可以有效地形成复合物,通过内吞作用使复合物可进入细胞中。多聚物即利用阳离子多聚体如多聚左旋赖氨酸上的正电荷与DNA上的负电荷结合发生电性中和,而形成稳定的多聚物/DNA复合物。复合物仍带正电荷,可与细胞表面带负电荷的受体结合,而被摄入到细胞中。离子脂质介导的转染试剂,可有效地将DNA,RNA,siRNA或寡核苷酸引入广泛的细胞类型,包括:Lipofectamine®2000、Lipofectamine®3000试剂

 

(图片来源于网络)

  • 电转介导的转染

电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后,在细胞膜上暂时形成小孔或开口,把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。其过程简述如下:首先在电击过程中,细胞膜上出现穿孔,质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触,并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。

 

(图片来源于网络)

  • 病毒介导的感染

病毒感染主要依赖于细胞表面所携带的受体,通过与受体的结合将病毒载体所携带的基因释放到宿主细胞内达到相应的过表达、干扰或者敲除。目前,细胞水平实验常用的病毒载体有慢病毒载体和腺病毒载体。慢病毒载体转导是获得基因稳转最常用的一个载体,腺病毒载体可以高效的感染几乎所有的细胞系,是基因瞬时表达的高效转导载体。

三大类基因转导方式比较:

 

目前,没有一种方法适用于所有的细胞和实验,根据实验内容合理的选择实验条件,选择合适的在转染方法,最终达到拿到理想的实验结果、节省了科研经费、耗费了较短的时间。

Part 3. 基因转导方案选择流程

 

因为不同细胞间的差异,基因转导效率相差较大。通过选择合适的转染试剂可以提高瞬转的效率,对于一些难感染的细胞建议使用腺病毒载体进行感染,可以极大的提高外源基因的转导效率。

如需获得外源基因的长期稳定表达,慢病毒感染的方法是首选,慢病毒可以将外源基因整合至细胞基因组中,实现长期稳定表达,对于难感染的细胞可以通选择高效的助感染试剂或者提高MOI值提供转导效率。

 

各位童鞋,细胞实验中基因转导的基础知识汇总就到这里,您可以根据实验内容、经费条件、实验周期等因素综合考虑选择合适的转导方法。